PSII可與PSI協(xié)同從水中獲取電子生成還原體、驅動光化學反應和植物營養(yǎng)循環(huán)。因此有效PSII光反應中心（[PSII]active）的含量可作為植物生產(chǎn)力評估的基礎因子，同時也是評估植物光合速率、研究植物脅迫響應的關鍵。而對于液體樣品，[PSII]active含量同樣是評估水生生物光合作用速率以及分析浮游植物對脅迫的響應的關鍵參數(shù)。但傳統(tǒng)上缺少穩(wěn)定、可靠、快速的 [PSII]active含量的測量方法。

      傳統(tǒng)上對于[PSII]active的測量：

• 免疫印跡法測定PSII蛋白復合體的豐度：

        不能說明其中能夠貢獻于持續(xù)電子傳遞的、光化學有效的PSII蛋白復合體的含量。

• 放氧法對[PSII]active含量值進行測量：

        耗時長：每個樣品要測量大概15 min；不準確；需要濃縮懸浮物樣品至很高的濃度，才能檢測到明顯的參數(shù)變化。同時，在測量過程中，氧氣的消耗及其多種代謝途徑會影響測量結果。因此不適合測量培養(yǎng)物的動態(tài)生理變化，更不適合測量持續(xù)變化環(huán)境中的自然種群。因而無論對于實驗室研究還是野外實驗，很多情況下都不適用。

      本文將介紹加拿大蒙特愛立森大學的Campbell教授的研究------應用FRR葉綠素熒光誘導技術進行[PSII]active含量估算的方法。該方法有效解決了傳統(tǒng)測量方法存在的問題。其原理是：在一定體積下：

a）F’_o強度與[PSII]active色素含量相關；

b）σ’_PSII與PSII色素總含量相關。

        因此，F’_o/σ’_PSII可以代表單位體積的[PSII]active含量。(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)。而這兩個參數(shù)都可以利用快速飽和及弛豫熒光誘導程序（fast repletion and relaxation (FRR) ?uorescence induction）獲得。（注：σ’_PSII: 光適應狀態(tài)下PSII的有效吸收截面；F’_o：光適應下的基礎熒光。）

        為了證明該方法用于估算[PSII]active含量可靠、可行，即受非光化熒光淬滅影響很小、測量快速并且穩(wěn)定、具有時間分辨性、可應用于對湖泊和海洋水體的初級生產(chǎn)力的快速評估，該研究進行了209次成對測定，對不同培養(yǎng)和處理條件下的海洋藍藻、分別在高光和低光處理下的原生態(tài)型球藻、北極和溫帶的綠藻、兩種中心硅藻進行測試。

        由于藻類的生理狀態(tài)對培養(yǎng)密度、光照條件、氣體狀態(tài)、溫度、pH值等都很敏感，進而直接影響所得參數(shù)和公式的科學性，所以需要精確控制培養(yǎng)條件并實時監(jiān)測培養(yǎng)狀態(tài)。因此本研究使用FMT150光養(yǎng)生物反應器對中心硅藻兩個藻株分別在2種不同狀態(tài)下進行培養(yǎng)和監(jiān)測，精確控制營養(yǎng)濃度、溫度、光照，并自動進行恒化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中儀器自動使用水蒸氣飽和的空氣氣泡混勻，避免沉降。（FMT150光養(yǎng)生物反應器介紹見后附）

        之后使用FL3500（當前升級為FL6000）測量每個樣品的F’_o和σ’_PSII，用以計算[PSII]active。FL3500可自動控制和測量樣品溫度、預施光照、光化光、單周轉飽和光閃、Q_A再氧化等8種默認測量程序、精確自定義程序等。

        同時使用熒光光纖氧氣傳感器測量密閉比色皿里樣品的溶氧濃度。氧氣的測量可由儀器自帶軟件程序自動控制。

        放氧測量過程如下圖所示：在FRR測量過程中，氧氣濃度隨激發(fā)光變化并與時間（橫軸）相對應。將氧探頭固定在FL3500自動控溫探頭上，一同插入FL3500測量單元內的待測樣品中。FL3500具有磁力攪拌功能，該功能可由觸控面板控制，也可由FL3500自帶軟件FluorWin程序精確定義。

         在初始300s的暗適應過程中記錄氧氣濃度作為暗呼吸值；之后用低光（20 µmol.m^-2.s^-1）進行預光照激活光系統(tǒng)并測量氧氣；在一個FRR程序結束后立刻測量氧氣濃度作為在FRR過程中的呼吸。二者差值用于估算樣品中[PSII]active含量。

        之后將樣品置于光下300 s；再次進行FRR誘導（見下圖）并測量氧濃度。再次估算樣品中[PSII]active含量。公式為：

μmol PSII L-1=μmol O2s-1L-1×（25.025×10-3s Flash-1）×(4 Flash 1×1 PSII/O2)

        FRR測量過程如下圖所示：先進行300 μs的暗適應。預光照之后使用40個（間隔2 μs）單周轉光閃（1.2 μs， 65000 µmol.m^-2.s^-1）的激發(fā)序列進行FRR誘導，以逐漸關閉全部PSII；在這個過程中得到F_o、F_M、σ_PSII、ρ（表示PSII 光反應中心的連通性）。之后降低光閃重復速率，PSII逐漸打開，此過程持續(xù)0.25 s。黑暗2 s，PSII打開。再施加第二次FRR誘導，得到F’_o2、F’_M2s、σ’_PSII2s……

        使用放氧法得到的[PSII]active對FRR得到的 [PSII]active=F’_o/σ’_PSII 公式進行校正，得到校正參數(shù)。

        本研究驗證了前人(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)的假設，應用FRR測量得到的[PSII]active矯正公式適用于本文所述所有藻類樣品，包括：呈指數(shù)增長的樣品、短期生理波動的非穩(wěn)態(tài)樣品、光抑制樣品、低濃度樣品、光適應下的樣品，并且受非光化熒光淬滅影響很小。

         因此可以用FRR測量程序來估算湖泊和海洋不斷變化的環(huán)境中的初級生產(chǎn)力。

        本案例文獻： Murphy C. D., Ni G., Li G., et al. (2016) Quantitating active photosystem II reaction center content from fluorescence induction transients. Limnol. Oceanogr. Methods. DOI:10.1002/lom3.10142

1. 本研究應用的FMT150藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測系統(tǒng): 詳見北京易科泰生態(tài)技術有限公司網(wǎng)站

        FMT150 光氧生物反應器為捷克PSI公司生產(chǎn)，北京易科泰生態(tài)技術有限公司為PSI公司在中國的*家代理。FMT150容量分為400ml、1000ml、3000ml。另有訂制大型版。

        FMT150將生物反應器與監(jiān)測儀器*地結合在一起，用于淡水、海水藻類和藍細菌（藍藻）等的模塊化精確光照培養(yǎng)與生理監(jiān)測。

ü 控制單元：包括電腦與預裝軟件。用戶自定義程序自動改變培養(yǎng)條件并實時在線監(jiān)測培養(yǎng)條件與測量參數(shù)。光強、光質、溫度和通入氣體的組分與流速都可以精確調控。恒濁和恒化控制模塊用于自動調控培養(yǎng)基的pH值和濁度?？刂茊卧赏瑫r控制多臺FMT150進行同步實驗，保證不同處理實驗間的一致性。

ü 監(jiān)測單元：包括溶氧、CO₂、pH、培養(yǎng)光強、溫度、OD 680、OD 720、以及葉綠素熒光參數(shù)Ft、Fo、Fm、Fm′和QY。

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3. 本研究中FRR（該功能須提前訂制）測量儀器：FL3500 （當前已升級為FL6000）:

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        FL6000 雙調制葉綠素熒光儀為捷克PSI公司生產(chǎn)，北京易科泰生態(tài)技術有限公司為PSI公司在中國的*家代理。有標準版和快速版。本研究應用的FRR測量程序為快速版提供。

        具備雙通道測量控制，一個通道用于對藍綠藻或綠藻等微藻，葉綠體或類囊體懸浮物、葉片碎片進行葉綠素熒光測量；另一個可選擇使用：測量和控制樣品溫度或者氧氣。此外可選配遠紅光源（735 nm）、磁力攪拌等功能。

        FL6000的測量單元提供毫秒級低強度測量光閃、超短單周轉光、以及持續(xù)光化光，三者的強度和持續(xù)時間全部可通過軟件實現(xiàn)非周期的精確編程控制。檢測器為500 kHz/16位 AD 轉換的PIN二極管信號檢測器，測量葉綠素熒光信號的時間分辨率可高達4 µs（快速版為1µs）。AD轉換的增益和積分時間同樣可以通過軟件精確控制。

        內置測量程序如下：

        應用領域：光合自養(yǎng)生物懸浮物生理研究、PSII光化學效率測量、水體初級生產(chǎn)力估算、浮游植物的光合作用和代謝擾動、藻華研究、藻類抗脅迫能力或者易感性研究、光合系統(tǒng)工作機理研究、受脅迫植物光合生理應對策略研究等。

        北京易科泰生態(tài)技術有限公司是由科學家創(chuàng)建并為科學家提供科技服務的新技術企業(yè)，是PSI公司在中國的*家代理和技術咨詢服務中心。易科泰生態(tài)技術公司在青島、西安設有分公司，在全國各地設有辦事處，北京總部設立有 EcoLab 實驗室以提供實驗研究合作、儀器技術培訓等。