FluorCam葉綠素熒光系統(tǒng)發(fā)表文獻選錄（十六）

——大田與野外的光合作用研究

高等植物、藻類、地衣以及苔蘚等對地球生物圈大的貢獻就在于其光合作用。因此，對這些植物的光合作用研究是極其重要的。而光合作用研究中一項*的技術就是葉綠素熒光及成像分析技術。

*，在實驗室條件下與野外自然條件下，植物的生理狀態(tài)可能會有很大的差異。而由于光合生理的特殊性（要求測量活體樣品，樣品離體后會有快速變化，且不能使用低溫等常規(guī)保存手段），要想準確獲得野外條件下的葉綠素熒光數(shù)據(jù)，就必須在野外進行原位測量。這在大田農(nóng)作物和野外生理生態(tài)研究中尤為重要。

因此，這就需要有專門用于大田和野外的葉綠素熒光及成像儀器。FluorPen/AquaPen手持式葉綠素熒光儀輕便小巧，具備測量脈沖調(diào)制式熒光淬滅曲線和OJIP快速熒光動力學曲線的功能，同時配備多種探頭適用于不同實驗需求，但其不具備成像功能，難以全面反映植物光合生理的差異。FluorCam便攜式葉綠素熒光成像儀是一款既可以在實驗室工作，也可以很方便地進行大田野外測量的葉綠素熒光成像儀。它可以進行葉片、藻類、苔蘚、地衣等各種不同樣品的脈沖調(diào)制式葉綠素熒光成像分析。而如果想在野外大田進行整株植物乃至群體的光合生理，那么FluorCam移動式葉綠素熒光成像系統(tǒng)則是*，其35×35cm的有效成像面積是目前野外脈沖調(diào)制式葉綠素熒光成像技術所能達到的大成像面積。

左：FluorPen手持式葉綠素熒光儀；中：FluorCam便攜式葉綠素熒光成像儀；右：FluorCam移動式葉綠素熒光成像系統(tǒng)

應用文獻案例：

1.水稻稻瘟病、白葉枯病與干旱抗性的大田無損定量檢測

水稻作為種植面積廣泛的作物，從而面臨一系列的環(huán)境挑戰(zhàn)。在熱帶和亞熱帶地區(qū)，水稻面臨的主要非生物脅迫就是干旱脅迫，同時如稻瘟病、白葉枯病等生物脅迫也會嚴重降低水稻的產(chǎn)量。氣候變化模型則預測環(huán)境變化將會進一步加重這兩類脅迫的發(fā)生頻率與強度。因此，通過快速、無損的植物表型光學分析技術進行這方面的研究就成為了極其迫切的任務。

左：感染稻瘟病和白葉枯病的水稻；中：葉綠素熒光Fv/Fm、QY數(shù)據(jù)；右：感染稻瘟病水稻的Fv/Fm葉綠素熒光成像圖

捷克科學院研究所聯(lián)合美國堪薩斯州立大學、水稻研究所等單位開展了這方面的研究。研究者通過FluorPen手持式葉綠素熒光儀和FluorCam便攜式熒光成像儀分別測量多種近等基因系水稻在不同脅迫下的葉綠素熒光參數(shù)。葉綠素熒光分析表明，光系統(tǒng)II大光化學效率（或稱大量子產(chǎn)額）Fv/Fm、實際量子產(chǎn)額QY_Lss和穩(wěn)態(tài)葉綠素熒光Ft_Lss都可以有效地分辨稻瘟病和白葉枯病。而在進行干旱脅迫檢測時，QY_Lss則效果較好。

2.南極生態(tài)研究

2006年，捷克在南極James Ross島建設了Johann Gregor Mendel站。駐扎該站的捷克馬薩里克大學與捷克科學院的科研人員從2007年就開展研究當?shù)卦孱惡偷匾聦?/span>南極溫度升高的響應，從而評估溫室效應對南極生態(tài)系統(tǒng)的影響。當時他們使用了專門加強極地適應能力的AquaPen/FluorPen系列手持式葉綠素熒光測量儀來檢測藻類和地衣的光合生理和生長狀態(tài)。AquaPen/FluorPen既可以手動操作，也具備無人值守監(jiān)測葉綠素熒光的功能，在南極的嚴酷環(huán)境下表現(xiàn)良好。

之后科研人員開始使用專門設計用于監(jiān)測實驗的Monitoring Pen葉綠素熒光自動監(jiān)測儀。Monitoring Pen在理想情況下可自動連續(xù)工作2年，配有陸地增強版和水下增強版兩個版本。

• Johann Gregor Mendel站2007-2009年使用的AquaPen/FluorPen；右：近年開始使用的Monitoring Pen 

在2019年的研究中，研究人員使用FluorPen手持式葉綠素熒光儀、FluorCam便攜式葉綠素熒光成像儀、FluorCam開放式葉綠素熒光成像系統(tǒng)和SpectraPen手持式光譜儀來綜合研究地衣Dermatocarpon polyphyllizum的溫度、干旱、高光等環(huán)境因素的響應機制。

FluorPen具備OJIP快速葉綠素熒光動力學曲線分析測量能力，可以快速獲取與植物/藻類光合生理與脅迫響應相關的二十余項參數(shù)。通過FluorCam便攜式葉綠素熒光成像儀進行的葉綠素熒光淬滅動力學（也稱為慢速葉綠素熒光動力學）分析，可以獲取植物/藻類光合電子傳遞從啟動到穩(wěn)定的變化過程，計算反映光化學效率、光系統(tǒng)熱耗散、光系統(tǒng)開放程度等一系列參數(shù)。

不同溫度處理后的地衣葉綠素熒光分析：左. OJIP快速葉綠素熒光動力學曲線；中. OJIP各項計算參數(shù)雷達圖；右：葉綠素熒光淬滅動力學曲線

FluorCam葉綠素熒光成像系統(tǒng)除了測量上述葉綠素熒光曲線與參數(shù)，關鍵的優(yōu)點是可以同時測量樣品每個點的葉綠素熒光動力學變化，從而獲得相應參數(shù)的成像圖，用于反映樣品整體狀態(tài)與不同部位的差異，能夠非常直觀地展現(xiàn)不同處理之間的差異。

干燥、復水與高光處理的地衣葉綠素熒光成像分析：左. a干燥處理后彩色成像；b復水48小時后彩色成像；c小熒光Fo：d大熒光Fm；e大光化學效率Fv/Fm；f非光化學熒光淬滅系數(shù)NPQ；右. 復水過程中熒光參數(shù)變化

同時，其他歐洲國家西班牙、意大利等的科學家也依托James Ross島Johann Gregor Mendel站開展了大量南極生態(tài)研究。比如西班牙薩拉曼卡大學使用FluorCam便攜式葉綠素熒光成像儀研究南極藍藻Hassallia antarctica的干燥與滲透壓脅迫對其光合能力的影響。

左：藍藻Hassallia antarctica顯微照片；右：不同濃度NaCl處理后Hassallia antarctica大光化學效率Fv/Fm變化曲線

3.生物膜侵蝕防治的研究

大理石雕像上經(jīng)常會覆蓋上綠色或黑灰色的生物膜。這種生物膜是藍藻、藻類和真菌的混合體，并會逐漸侵蝕大理石。這對很多大理石文物造成了不可估量的損傷。為了對戶外大理石雕像進行保護，歐洲尤其是意大利的相關科研機構開展了大量研究工作。

而為了評估生物膜的活性以及清洗后的效果，葉綠素熒光成像技術無疑是便捷、直接的技術。意大利弗洛倫薩應用物理研究所已經(jīng)使用的FluorCam便攜式葉綠素熒光成像儀進行了近十年的研究。早在2013年，他們就發(fā)表研究論文，介紹如何使用FluorCam便攜式葉綠素熒光成像儀檢測來自意大利佛羅倫薩的墓碑石片樣品上的地衣。他們從測量得到的熒光參數(shù)中發(fā)現(xiàn)QYmax（即Fv/Fm）與這些地衣的生物活力有密切的相關性。而且與可見光圖像相比，獲得的熒光圖像可以更加直接地表明地衣在巖石表面的活力分布并區(qū)分已死的和正常生長的地衣。

a）來自佛羅倫薩的墓碑樣品；b）使用FluorCam便攜式葉綠素熒光成像儀進行實驗

S2樣品的成像圖a）可見光成像b）葉綠素熒光Fm成像c）葉綠素熒光QYmax成像

在后續(xù)多年的研究中，他們一直在探索使用哪種清除技術，既能消除大理石上附著的生物膜，又不損傷大理石文物。

在近的研究中，他們使用523nm激光嘗試清除大理石雕像上的生物膜。FluorCam便攜式熒光成像儀為其檢測清除效果并優(yōu)化激光參數(shù)提供了相應的數(shù)據(jù)。

  左：通過葉綠素熒光成像圖驗證處理效果；右：工作中的FluorCam便攜式熒光成像儀

4.蟲癭光合特性研究

蟲癭是主要由昆蟲誘導寄主植物細胞分裂加速而產(chǎn)生的一種異常組織，通常發(fā)生在葉片。一方面蟲癭破壞了寄主植物的源庫關系，降低了蟲癭周圍組織的光合能力，抑制了寄主植物的生長發(fā)育，導致花、果實、種子和生物量的產(chǎn)量降低。另一方面，蟲癭會產(chǎn)生過氧化氫等活性氧物質（ROS），對寄主植物造成高氧化脅迫，而寄主植物則能夠通過產(chǎn)生酚類衍生物等次生代謝產(chǎn)物以減緩脅迫。

對蟲癭光合能力進行直接測量并與葉片進行比較，能夠使科學家更好的理解致癭昆蟲和寄主植物直接的關系。巴西烏貝蘭迪亞聯(lián)邦大學的Oliveira等人通過寄主植物Matayba guianensis—致癭昆蟲Bystracoccus mataybae互作體系，分析蟲癭組織光合活力和高氧化脅迫之間的平衡。

為評估蟲癭組織的光合活性，使用了FluorCam便攜式熒光成像系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)相比于非蟲癭組織，蟲癭組織大光化學效率Fv/Fm較低（表征光合活性），光下實際光化學量子效率φPSII（(Fm’–F’)/Fm’）與熒光衰減速率Rfd也較低，意味著其抵抗脅迫的能力也較差。結合氣體交換光合參數(shù)和組化分析的結果表明：綠色的蟲癭具備一定的光合活性，但受到了蟲癭內(nèi)幼蟲的呼吸、取食行為引發(fā)的高氧化性脅迫的損傷。而寄主植物則通過原生質中酚類衍生物和用于形成畸形石細胞的木質素的累積，起到減緩脅迫的作用。

左：寄主植物Matayba guianensis及葉片上的蟲癭；右：帶蟲癭葉片的葉綠素熒光成像

 5.空間站上的植物生理研究

美國航空航天局NASA一直在尋求一款可以在太空中直接測量植物生長狀態(tài)和光合生理的儀器。儀器既要輕便小巧，又要功能強大，在不需要對樣品進行太多處理的前提下就能獲取大量科學數(shù)據(jù)。

FluorPen手持式葉綠素熒光儀初就是應NASA這一要求開發(fā)的。在經(jīng)過充分的地面測試和前期試驗后，2017年4月，NASA的新一代先進植物培養(yǎng)器（Advanced Plant Habitat，APH）搭載聯(lián)盟號MS-04貨運飛船抵達空間站，而FluorPen手持式葉綠素熒光儀則作為配套檢測儀器一起進入了太空。

Advanced Plant Habitat設計圖

    宇航員按計劃展開了植物生理學及太空新鮮食物種植（ growth of fresh food in space）的研究。這不僅僅是為了研究植物在太空環(huán)境下生理活動的變化，更是希望能夠在未來為宇航員長期太空生活提供食物。甚至在NASA的長期規(guī)劃中，FluorPen還準備了用于火星表面光合生命的檢測以及探索地球植物在火星生活的可能性。同時，NASA也在探討將更先進的FluorCam葉綠素熒光成像系統(tǒng)發(fā)射到空間站。

左：NASA*航天中心的工程師使用FluorPen葉綠素熒光儀檢測Advanced Plant Habitat中的擬南芥；右：FluorPen葉綠素熒光儀和Advanced Plant Habitat在空間站上的實際工作場景

參考文獻：

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3. Mare?ková M, et al. 2019. Temperature effects on photosynthetic performance of Antarctic lichen Dermatocarpon polyphyllizum: a chlorophyll fluorescence study. Polar Biology 42(4): 685–701
4. Mishra KB, et al. 2019. A correlative approach, combining chlorophyll a fluorescence, reflectance, and Raman spectroscopy, for monitoring hydration induced changes in Antarctic lichen Dermatocarpon polyphyllizum. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 208: 13-23
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7. Mascalchi M, et al. 2018. Laser removal of biofilm from Carrara marble using 532 nm: The first validation study. Measurement 130: 255-263
8. Oliveira D C, et al. 2017. Sink status and photosynthetic rate of the leaflet galls induced by Bystracoccus mataybae (Eriococcidae) on Matayba guianensis (Sapindaceae). Front. Plant Sci. 24
9. NASA Facts：Advanced Plant Habitat

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